Гепатология
   

 

Основные принципы, положенные в основу диагностических тестов

 

 

 

 

Гепагент

Помогите своей печени!

Бесплатная консультация специалиста!

 

 

 

 

 

   

Совокупность методов, позволяющих выявлять в биологических тканях и жидкостях специфические вирусные или бактериальные белки (антигены) или антитела, вырабатываемые в организме хозяина в присутствии того или иного возбудителя, относят к иммунологическим методам лабораторного анализа. Серологические исследования (определение вирусных белков и антител к ним в сыворотке крови) являются главным методом первичной диагностики вирусных заболеваний печени. Они широко распространены, относительно дешевы, представлены большим количеством коммерческих тест-систем, обладают высокой воспроизводимостью результатов. К недостаткам серологических методов относятся трудности в Диагностике ранних стадий инфекции, инфекций у больных со сниженным иммунным ответом, инфекций, вызванных мутантными штаммами вирусов.

Первичным серологическим методом исследования в настоящее время является иммуноферментный анализ (ИФА). Радиоиммунные методы исследования используются все реже, в связи с тем, что современные диагностические системы, в основу которых положен ИФА, столь же точны, проще для выполнения и позволяют избежать проблем, связанных с использованием радиоактивного материала. В основе ИФА лежит добавление исследуемой сыворотки к фиксированным вирусным антигенам. Если в исследуемом образце имеются антитела, специфичные для данного антигена, они свяжутся с образованием иммунных комплексов. При отсутствии антивирусных антител комплексы не образуются. Далее несвязанный материал смывается, и в раствор добавляются детекторные антитела (антитела к Fc фрагменту иммуноглобулинов человека), связанные с ферментом, который в определенных условиях способен вызывать хемилюминесцентное свечение, которое и подтверждает в конечном итоге наличие специфических антител в исследуемом образце. ИФА имеет большое количество вариантов. Если детекторные антитела направлены против константного региона тяжелых цепей IgM, ИФА позволяет определить непосредственно антивирусные антитела класса М (показатель острой инфекции). Кроме того, вместо единичного белка может быть использована комбинация вирусных белков, что позволяет увеличить чувствительность и специфичность метода, как это используется в ИФА 2-го и 3-го поколения для определения анти-HCV. ИФА позволяет проводить также количественную оценку антивирусных антител.

Иммуноблот позволяет определить антитела к конкретным антигенам вируса (к каждому в отдельности) и наиболее широко используется в качестве теста, подтверждающего наличие инфекции HCV. При этом на нитроцеллюлозную мембрану адсорбируются 4 различных рекомбинантных антигена вируса. Результаты теста считаются положительными при наличии реакции с двумя и более антигенами.

В последние годы в практику диагностических лабораторий для методы молекулярной диагностики, позволяющие обнаруживать характеризовать последовательности ДНК и РНК. Своим развитием эти методы обязаны разработкой в 1983 г принципа полимеразной цепной реакции (ПЦР). Первые сообщения по практическому применению ПЦР появились в 1985г., и с тех пор количество публикаций, где ПЦР используется в качестве одного из методов исследования, занимает одно из первых мест в мировой научной литературе. Кроме ПЦР для обнаружения вирусных нуклеиновых кислот в сыворотке используют методы молекулярной гибридизации и метод "развлетвленных" ДНК зондов. Чувствительность и специфичность этих методов сопоставима с серологическими методами анализа, они позволяют получить непосредственное представление о репликации вируса, а также распознать инфекцию на ранней стадии, когда результаты иммунологических и биохимических тестов могут еще не отклоняться от нормы. Кроме того, молекулярные методы диагностики позволяют различить текущую и разрешившуюся инфекции, количественно определить вирусную нагрузку и отслеживать ее изменение в процессе лечения. Эти методы технически более сложные, чем ИФА, а ПЦР настолько высоко чувствительна, что имеются реальные предпосылки для получения ложно положительных результатов за счет заражения образца при проведении анализа.

Одним из первых и наиболее простых подходов к определению вирусных HK явилась молекулярная гибридизация. Вирусные HK выделяются из сыворотки и фиксируются на нитроцеллюлозной мембране, которая в дальнейшем выдерживается совместно с олигонуклеотидами, содержащими нуклеотидные последовательности, комплементарные вирусным. Пробы помечают радиоактивным изотопом, хемилюминесцентными маркерами или ферментами, которые сигнализируют о связывании олигонуклеотидов и вирусных HK. Методы гибридизации позволяют количественно оценить содержание в исследуемом образце, но обладают значительно меньшей чувствительностью, чем ПЦР. Поскольку содержание ДНК HBV в сыворотке крови на несколько порядков превышает концентрацию РНК HCV, методы молекулярной гибридизации для количественной оценки последней не применяют.

В основе метода гибридизации с использованием разветвленных зондов лежит усиление сигнала, а не амплификация молекул HK. В микролунки, на которых адсорбированы олигонуклеотиды, специфичные для исследуемой HK добавляются сывороточные ДНК или РНК. Далее происходит связывание с синтетической молекулой разветвленной ДНК, и гибридизацией с пробой, меченной щелочной фосфатазой и усилителем достигается значительное усиление (в 105 раз) полученного в процессе ферментативной реакции сигнала. К достоинствам метода относится хорошая стандартизация, относительная простота выполнения, к недостаткам - присущая всем гибридизационным методам низкая чувствительность.

Наиболее чувствительным из молекулярных методов анализа является полимеразная цепная реакция (ПЦР), которая позволяет увеличить количество копий ДНК до уровня, который может быть легко определен в пробе. Теоретически, условия проведения ПЦР должны обеспечить определение даже единичной копии ДНК. ПЦР представляет собой циклический процесс, в каждом круге которого количество ДНК удваивается. Так, если в начале реакции в исследуемом образце присутствовала одна копия исследуемой ДНК, через 10 циклов ее количество увеличится до 210 (приблизительно 1000) копий. Обычно ПЦР состоит из 30-40 циклов, что позволяет увеличить количество исследуемой ДНК до нескольких миллионов копий, то есть уровня, который легко зафиксировать при помощи электрофореза в полиакриламидном геле или с применением гибридизации с полиакриламидными зондами. Каждый цикл реакции состоит из трех шагов: денатурации, ренатурации и синтез новых цепей ДНК. В реакцию включаются вся ДНК, выделенная из образца, пара праймеров, свободные нуклеотиды и термостабильная ДНК-полимераза. Праймеры редставляют собой небольшие участки ДНК или олигонуклеотиды, омплементарные и специфичные для исследуемой ДНК. В начале еакции смесь разогревается до температуры, при которой происходит разделение (денатурация) двухцепочечной ДНК на две цепочки. Затем, смесь охлаждается, так, что праймеры могут связаться с комплементарными участками цепочек. На последнем этапе температура реакции вновь повышается до оптимальной для действия ДНК-полимеразы. Из свободных нуклеотидов происходит синтез комплементарных цепочек, и из одной копии ДНК получается две. Затем цикл повторяется.

При помощи ПЦР можно увеличивать количество копий ДНК, но не РНК. Для определения вирусной РНК необходим дополнительный шаг: после выделения РНК из образца ткани или сыворотки при помощи обратней транскриптазы воспроизводится копия ДНК, которая затем включается в описанную выше реакцию. Для повышения чувствительности и специфичности ПЦР предложен метод гнездовой ПЦР, при которой используется одновременно две пары праймеров, одна из которых комплиментарно связывается с внутренним участком ампликона, полученного после первого цикла амплификации. Принцип цепной реакции, обеспечивающий увеличение копий НК до уровня, который легко зафиксировать в исследуемых образцах, реализуется также в методах лигазной цепной реакции, амплификации последовательностей HK (NASBA) и амплификации, опосредованной транскрибцией (ТМА).

ПЦР может быть использована не только для качественного, но и для количественного определения ДНК или РНК Известные коммерческие тест-системы оценки концентрации НК реализуют принцип конкурентной ПЦР с последующей гибридизационной схемой определения продуктов амплификации. Этот подход основан на внесении в клинический образец внутреннего стандарта известной концентрации, качественно отличающегося от определяемой матрицы. После ПЦР концентрация НК в исследуемом материале рассчитывается на основании известной концентрации внутреннего стандарта и соотношения накопления продуктов амплификации внутреннего стандарта и определяемой матрицы.

Большинство отечественных лабораторий для оценки концентрации НК используют метод предельных разведений. В основе его лежит раститровка анализируемой матрицы до исчезающих концентраций и вычисление исходной концентрации на основании результатов амплификации в сравнении с калибровочной кривой. К сожалению, этот метод не достаточно точен, так как не учитывает возможность подавления реакции амплификации в пробирке с исследуемым образцом. Тем не менее, метод достаточно прост в исполнении и до сих пор используется в ряде лабораторий для "внутреннего пользования".

Вернуться на главую

См также в разделе ОБСЛЕДОВАНИЕ БОЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ ПЕЧЕНИ