Гепатология
   

 

Диагностика инфекции вирусом гепатита С (HCV)

 

 

 

 

Гепагент

Помогите своей печени!

Бесплатная консультация специалиста!

 

 

 

 

 

   

Вирус гепатита С (HCV) является гепатотропным и лимфотропным вирусом, содержащим РНК, который относится к семейству Flaviviridae. Геном вируса представлен одноцепочечной молекулой (+) РНК размером около 9500 оснований, кодирующей структурные и неструктурные белки.

К структурным белкам относят белок сердцевины (кор) и гликопротеины оболочки (Е1 и Е2). Неструктурную область представляет комплекс белков с ферментативной активностью, в первую очередь РНК-зависимая-РНК полимераза. Снаружи вирион покрыт липидной оболочкой, состоящей из липопротеинов организма хозяина низкой плотности.

До 1990г. хронический гепатит "ни-А-ни-В" с парентеральным путем передачи диагностировали на основании повышенной активности АЛТ сыворотки в течение 6 месяцев, при отсутствии других известных маркеров ВирУсНЫХ гепатитов В современной диагностике гепатита С основная роль отводится определению антител к HCV (анти-HCV) и РНК HCV.

В отличие от гепатита В, при котором могут быть определены антигены вируса и антитела к ним, при гепатите С методом ИФА определяются только антитела. Антигены HCV, если и попадают в кровь, то в количествах, которые практически не регистрируются. Они могут быть обнаружены только в ткани печени при использовании иммунногистохимических методов исследования.

Анти-HCV могут являться признаком как текущей, так и перенесенной инфекции. У лиц, которым была перелита зараженная кровь, могут обнаруживаться анти-HCV донора. У больных хроническим гепатитом С анти-HCV обнаруживаются в крови не только в свободной форме, но и в составе циркулирующих иммунных комплексов.

Антитела образуются к каждому из вирусных белков, расположенных в структурной и неструктурной области вирусного генома. Этим определяется их различная специфичность и, соответственно, разная диагностическая ценность. Для скрининга гепатита С используют метод ИФА, а в качестве подтверждающего теста - метод иммунноблота. Существует несколько поколений диагностических систем для выявления анти-HCV, отличающихся своей чувствительностью и специфичностью.

Первая диагностическая система на основе определения антител к С-100-3 была разработана в 1989 году в лаборатории М. Houghton и быстро получила повсеместное распространение. Она позволяла улавливать антитела в зоне, характеризующей всего 12% вирусного белка в неструктурной области (NS3, NS4). Кроме того, искусственный рекомбинантный антиген С-100-3 не полностью совпадает с натуральными вирусными белками, что предполагает его слабую иммунногенность. Антитела к белку С (cor Ag) с помощью антигена С-100-З вообще не улавливаются. Это предопределило низкую специфичность определения анти-HCV и большое число ложноотрицательных результатов у больных хроническим гепатитом С. У больных с выраженной гипергаммаглобулинемией наоборот, тест С-100-3 часто является ложноположительным.

Тест-системы 2-го поколения, возникшие в 1991 году, позволяют улавливать антитела к белкам в разных зонах генома не только неструктурной, но и структурной области. Их преимуществом явилась, прежде всего, высокая специфичность, а также возможность более полного представительства спектра антигенов HCV. Использование диагностических систем 2-го поколения позволило улучшить отбор доноров и снизить риск развития посттрансфузионного гепатита С.

При использовании диагностических систем 2-го поколения также не исключены ложноотрицательные результаты, в частности, у больных с необычными для данного региона генотипами HCV. Наиболее совершенны диагностические системы 3-го и 4-го поколения, использующиеся в клинической практике начиная с 1995 года.

Диагностические системы 3-го и 4-го поколения позволяют выявить анти-HCV в 99,7% случаев. В некоторых случаях антитела к HCV могут не обнаруживаться, например, при запаздывании иммунного ответа, применении иммуносупрессивной терапии или угнетении иммунитета на фоне онкологического заболевания, приема наркотических веществ и т.д. Очень редко наблюдаются ложноположительные результаты. Для их исключения сомнительные сыворотки анализируют при помощи иммуноблота, что позволяет выявить антитела к каждому белку HCV по отдельности.

Методы молекулярной диагностики HCV позволяют непосредственно выявить генетический материал вируса в сыворотке крови и тканях (мононуклеарах, гепатоцитах, ткани костного мозга я т.д.); оценить репликативную активность вируса в тканях; количественно определить концентрацию вируса в сыворотке крови; установить генотип вируса и наблюдать за изменчивостью HCV.

Обнаружение в сыворотке крови РНК HCV является "золотым стандартом" диагностики, свидетельствующем о продолжающейся репликации HCV. По рекомендации ВОЗ установление диагноза гепатита С возможно на основании троекратного обнаружения РНК HCV в сыворотке крови больного при отсутствии других маркеров гепатита. В острую фазу гепатита РНК выявляется в крови через 1-2 недели после заражения, задолго до появления анти-HCV.

Все генетические варианты вируса имеют консервативный участок в 5-нетранслируемой области генома, на обнаружении которого основаны большинство систем диагностики РНК HCV. Для оценки репликативной активности HCV в тканях используется реакция на (-) цепь РНК.

Особенностью HCV является его генетическая неоднородность, связанная с быстрой замещаемостью нуклеотидов. В результате образуется большое число генотипов и подтипов. По классификации Simmonds выделяют 11 типов (генотипы 1-11), в свою очередь подразделяющихся на 70 подтипов (например, подтипы 1а, 1в, 1c) HCV. Особенно много подтипов HCV регистрируется в Африке и Юго-Восточной Азии, что косвенно указывает на существование HCV в этих регионах в течение нескольких столетий. Допускают, что в Европе и Северной Америке HCV появился позднее. Этому соответствует значительно меньшее количество определяемых подтипов HCV. Для клинической практики достаточно разграничивать 5 подтипов HCV: 1a, 1b, 2а, 2b, За. Имеются географические различия в распространении разных генотипов. Так, в Японии, на Тайване, частично в Китае, выявляются преимущественно генотипы 1b, 2а, 2Ь. Тип 1b даже называют "японским". В США преобладает 1а - "американский" генотип. В Европейских странах преобладает генотип HCV 1 а, в Южной Европе заметно возрастает доля генотипа1b. На территории Российской Федерации преобладающим генотипом является 1b, составляющий 80 % популяции вируса, далее с убывающей частотой - За, 1а, 2а. Наиболее благоприятный ответ на противовирусное лечение наблюдается у лиц с генотипом 2 или 3.

Обычным методологическим подходом для типирования HCV является обнаружение характерных генетических изменений (мутаций) в консервативных областях вирусного генома - 5-нетранслируемой, cor, NS5A. Типирование HCV представляет собой амплификацию консервативных областей вирусного генома и анализ специфичных нуклеотидных последовательностей. Наиболее часто используется метод обратной гибридизации с типоспецифичными зондами. В ряде крупных диагностических центров типирование HCV проводят по оригинальным методикам, используя ПЦР с типоспецифичными праймерами, рестриктазный анализ фрагментов ДНК (RFLP), или конформационный анализ одноцепочечных фрагментов ДНК (SSCP).

Поскольку РНК-полимераза HCV не контролируется «верно-считывающей» 3-5 экзонуклеазой, репликация вируса протекает с большим количеством ошибок, в связи с чем HCV всегда присутствует in vivo как квазивид - динамическая популяция генетически близких вариантов вируса, половина или более из которых идентичны, образуя главную («мастерскую») последовательность, а остальные являются смесью мутантов, отличающихся друг от друга несколькими нуклеотидами. Особенной нестабильностью характеризуется участок E2/NS1 генома HCV, содержащий 80 нуклеотидов и получивший название гипервариабельного участка (HVR1). Предполагают, что именно антитела к белкам, кодируемым участком генома E2/NS1, обладают нейтрализующими вирус свойствами. Исключительная нестабильность HVR1 приводит к тому, что вирус быстро меняет антигенную структуру, в связи с чем иммунокомпетентные клетки не в состоянии распознать непрерывно обновляющиеся антигены. С наличием квазивида связывают феномен ускользания вируса от иммунного ответа, неэффективное удаление HCV, его длительное сохранение в организме человека (высокий процент хронизаций инфекции). Оценку гетерогенности индивидуальной популяции HCV принято проводить на основании регистрации числа генетических вариантов HVR1 вирусного генома методами гетеродуплексного ализа или SSCP. Клиническое значение высокого уровеня гетерогенности индивидуальной популяции HCV по HVR1 подлежит уточнению.

Вернуться на главую

См также в разделе ОБСЛЕДОВАНИЕ БОЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ ПЕЧЕНИ