Гепатология
   

 

Диагностика инфекций вирусами гепатита В и дельта (D)

 

 

 

 

Гепагент

Помогите своей печени!

Бесплатная консультация специалиста!

 

 

 

 

 

   

Вирус гепатита В (hepatitis В virus, HBV) относится к семейству Hepadnoviridae. При световой микроскопии HBV выглядит сферической частицей диаметром 42 нм (частица Дейна), состоящей из ядра-нуклеотида, имеющего форму икосаэдра диаметром 28 нм, внутри которого находится двуцепочечная ДНК, концевой белок и ДНК-полимераза. В состав нуклеоидного белка входят HBcAg и HBeAg. Внешняя оболочка (толщиной 7 нм) образована поверхностным антигеном HBV - HBsAg. Вирус гепатита В является псевдоретровирусом, то есть ДНК HBV может частично встраиваться в геном гепатоцитов.

Основой лабораторной диагностики инфекции HBV является определение серологических маркеров вируса: HBsAg, HBeAg, анти-НВс класса IgM и IgG, анти-HBe и анти-HBs, ДНК HBV и активности вирусной ДНК-полимеразы.

HBsAg - поверхностный антиген HBV - основной маркер инфицирования HBV. При остром гепатите В в большинстве случаев (90-80 %) HBsAg удается выявить в инкубационном периоде, начиная с 3-5 недели заражения. Средняя продолжительность циркуляции антигена - 70-80 дней. Быстрое исчезновение HBsAg (в первые дни желтухи) с появлением анти-HBs - плохой прогностический признак При хроническом гепатите В HBsAg может циркулировать в крови больного на протяжении многих лет. Следует отметить, что применяющиеся в настоящее время методы определения HBsAg, в том числе ИФА, имеют порог чувствительности. Поэтому при наличии клинических признаков гепатита и отсутствиии HBsAg в сыворотке крови необходимо исследовать другие маркеры инфекции HBV. Наличие HBsAg в крови свидетельствует о присутствии вируса в печени и с большой долей вероятности - в крови.

HBsAg (растворимый, промежуточный, оболочечный) антиген вируса гепатита В характеризует высокую инфекционность крови, являясь показателем репликации HBV. HBsAg циркулирует в крови больного только в присутствии HBsAg. В первую неделю желтушного периода он выявляется у 85-95 % больных. Выявление HBsAg в течение двух и более месяцев служит прогностическим признаком развития хронического гепатита. У большинства больных хроническим гепатитом с высокой активностью процесса HBsAg сохраняется на длительный срок (до нескольких лет).

Антитела класса М являются маркером «первой встречи» организма с антигеном, и появление их трактуется обычно в рамках острой инфекции. Антитела к ядерному антигену вируса гепатита В класса М (анти-НВс IgM) выявляются через 1-2 недели после обнаружения HBsAg и сохраняются на протяжении 2-18 месяцев. В ряде случаев у больных острым гепатитом В анти-НВс IgM являются единственным маркером инфекции.

Возможно появление анти-НВs IgM и анти-HDV IgM при хронической вирусной инфекции, не в виде иммунокомпетентных пентамерных молекул, а в виде атипичных мономеров. Их появление связано именно с тяжестью гепатита, а не с синтезом HD-Ag или HBsAg dе novo (то есть репликацией HDV или HBV). В этой ситуации главную роль приобретает количественное определение анти-НВs IgM. При обострении ронического гепатита титр анти-НВs IgM повышается, но обычно не достигает уровня, характерного для острого вирусного гепатита. Анти-НВs IgM в невысоком титре могут длительно сохраняться и в отсутствие обострения гепатита, даже после сероконверсии в HBs-системе. Обнаружение анти-НВs IgM и анти-HDV IgM у больных хроническим гепатитом является фактором, благоприятствующим успешному лечению интерфероном.

Антитела к HBsAg класса G (анти-НВs IgG) появляются практически одновременно с анти-НВs IgM. Как правило, они остаются у всех лиц, переболевших гепатитом В, пожизненно. У 95 % носителей HBsAg наряду с HBsAg циркулируют и анти-НВs IgG. Возможна ситуация, когда данный маркер является единственным серологическим признаком инфекции HBV. Это может быть в ситуации, когда при длительно существующей инфекции HBV произошла сероконверсия в HBs-системе, титр анти-HBs постепенно снизился ниже уровня, определяемого коммерческими тест-системами. В этом случае, вакцинация против HBV приведет к быстрому появлению анти-HBs в высоком титре. В другом случае, наличие «изолированных» анти-НВs может быть связано с очень низким уровнем репликации HBV и снижением концентрации HBsAg ниже, чем могут зафиксировать коммерческие тест-системы. В этом случае вакцинация против HBV не вызовет появления анти-HBs. Определение ДНК HBV также позволяет разграничить эти ситуации. Некоторые исследователи считают, что при обнаружении «изолированных» анти-НВс в сыворотке крови необходимо более тщательно исключать сопутствующую инфекцию, поскольку данный маркерный спектр может являться результатом межвирусного взаимодействия. Поскольку Ig G являются наибольшей составляющей общего пула антител, коммерческими тест-системами они определяются как анти-НВs «суммарные».

Антитела к HBsAg (анти-HBs) свидетельствуют о ранее перенесенной инфекции или о наличии поствакцинального иммунитета (защитный уровень - 10 МЕ/мл). Они появляются в период выздоровления, через 4 недели после исчезновения HBsAg, достигая максимальной концентрации через 1-2 года, с последующим постепенным снижением уровня, недоступного выявлению современными методами диагностики. В некоторых случаях анти-HBs могут циркулировать пожизненно. Появление анти-HBs на фоне клинического улучшения у больного гепатитом В является хорошим прогностическим признаком. Важно отметить, что в динамике острой инфекции HBV имеется "окно", когда HBsAg уже не определяется, а анти-HBs еще не появились. При этом выявляются анти-НВs IgM и IgG. Таким образом, у больных острым вирусным гепатитом необходимо исследовать анти-НВс IgM в сыворотке крови даже при отрицательных результатах исследования на HBsAg и анти-HBs.

Антитела к HBsAg (анти-НВs) появляются в крови после удаления HBsAg и завершения репликации вируса. К концу 9-й недели острого периода гепатита В более 90 % больных имеют анти-НВs. В период выздоровления анти-НВs могут исчезать. Однако, наличие анти-НВs не является показателем отсутствия инфекционности сыворотки крови. У ряда больных в ходе развития гепатита В под влиянием "иммунного давления" на вирус возникают мутантные формы, которые избегают иммунного надзора и не удаляются. У носителей анти-НВs был выделен штамм, неспособный продуцировать HBsAg из-за дефектов в области ргесоге и получивший название HBsAg-отрицательного мутанта. Появление HBsAg-отрицательного мутанта приводит к прогрессированию поражения печени при продолжающейся репликации вируса (наличие ДНК HBV в сыворотке крови). При первичном инфицировании HBsAg-отрицательным мутантом увеличивается риск развития фульминантного гепатита.

Появление мутантных штаммов способствует ряду феноменов: снижению клиренса вируса посредством иммунных механизмов (иммунное «ускользание»), уменьшению ответа на противовирусное лечение путем формирования и отбора устойчивых к препаратам штаммов (терапевтическое «ускользание»); приводит к формированию вариантов вирусов, не распознаваемых диагностическими системами к дикому типу (диагностическое и вакцинное «ускользания»). «Ускользающая» мутация в высокоантигенных областях (а-детерминанта) HBsAg приводит к появлению маркерного спектра, при котором в сыворотке определяются анти-HBs, HBsAg и ДНК HBV. Определены нуклеотидные последовательности двух «молчащих» мутантов х-рамки HBV, вызвавших острый и хронический гепатит В. При этом в сыворотке крови отсутствовали все антигены и антитела HBV.

Применительно к инфекции HBV выделяют две фазы: интеграции вируса в геном гепатоцита и фазу вирусной репликации. Следует помнить, что наличие репликации не является синонимом акивности гепатита, но отражает взаимодействие вируса и организма хозяина. Репликацию вируса доказывает обнаружение внутриклеточных продуктов трансляции. В повседневной врачебной практике принято делать заключение о репликации HBV на основании обнаружения любого из перечисленных маркеров: полных вирусных частиц, HBsAg, ДНК HBV, ДНК-полимеразы в сыворотке крови, наиболее часто исследуются HBsAg и ДНК HBV. Более доказательным считается обнаружение HBcorAg и РНК HBV в гепатоцитах.

Вирус гепатита D (дельта, HDV) является дефектным, и для реализации его патогенных свойств необходимо присутствие HBV, обеспечивающего поверхностный антиген для «упаковки» вируса, его передачи и распространения "из клетки в клетку" внутри пораженной печени. Репликация HDV происходит независимо от HBV, после того как HDV попадет в клетки. Таким образом, теоретически гепатит Дельта может наблюдаться в отсутствие инфекции HBV, но убедительных клинических доказательств этого к настоящему времени не получено. Осложняющим фактором при обнаружении HDV в отсутствие HBV является то, что HDV может подавлять репликацию HBV. Таким образом, отсутствие серологических маркеров HBV у больных гепатитом дельта не обязательно свидетельствует об отсутствии сочетанной инфекции HBV. С другой стороны, возможно, что подавление HDV репликации HBV приводит к самоограничению гепатита.

Выделяют два варианта течения инфекции HDV. Согласно первому (коинфекция) происходит одновременное попадание в гепатоцит HBV и HDV. Коинфекция развивается у лиц, не болевших и неиммунных в отношении HBV. При этом возникает совместный В и D гепатит с соответствующим серологическим ответом на оба вируса. В сыворотке могут одновременно определяться HBsAg и HD-Ag. Анти-HDV IgM появляются позднее, чем анти-НВс IgM и быстро исчезают из сыворотки. Анти-HDV IgG появляются позже, чем анти-HDV IgM и сохраняются в сыворотке в течение более которкого периода, чем анти-НВс IgG.

Вторая модель (суперинфекция) реализуется, когда HDV инфицируются носители HBsAg. Такой вариант обычно проявляется клиникой ОВГ D, сопровождающейся быстрым появлением анти-HDV IgG при одновременном снижении титра HBsAg в сыворотке крови и гепатоцитах, что принято связывать с потреблением его реплицирующимся HDV. Уровень хронизации в результате перенесенной коинфекции HBV/HDV сравним с уровнем хронизации в результате перенесенного ОВГ В. Большинство случаев развития XT D являются результатом суперинфекции HDV носителя HBsAg. В течений суперинфекции HDV целесообразно выделять три фазы:

  1. острую, сопровождающуюся подавлением репликации HBV, высоким уровнем РНК HDV и аминотрансфераз сыворотки;
  2. хроническую фазу (в которую происходит реактивация HBV), сопровождающуюся снижением уровня РНК HDV и аминотрансфераз
  3. позднюю фазу, соовождаюшуюся развитием ЦП и/или гепатоцеллюлярной карциномы на фоне продолжающейся репликации обоих вирусов, или ремиссию, вследствие уменьшения их репликативной активности.

Суммарные анти-HDV (основную часть которых составляют Ig G) обнаруживаются в сыворотке крови в острую и хроническую фазу инфекции HDV. Их титр коррелирует с уровнем репликации HDV и помогает отличить текущую инфекцию от перенесенной.

Методы молекулярной диагностики позволяют непосредственно выявить возбудитель, установить тканевую и внутриклеточную локализацию HBV и HDV, выявить и охарактеризовать мутантные формы вируса, оценить уровень виремии в течение заболевания, в том числе - на фоне противовирусной терапии. Одним из вариантов качественного определения ДНК HBV является технология ПЦР in situ (в гистологических срезах), позволяющая установить внутриклеточную локализацию вируса в гепатоцитах.

Количественная характеристика содержания ДНК HBV в клинических образцах важна для оценки эффективности противовирусной терапии и имеет прогностическое значение в определении хронизации HBV. При исходно низком уровне виремии (ДНК HBV менее 500 фг/мкл) вероятность хронизации острого гепатита В минимальна, при концентрации ДНК HBV от 500 до 2000 фг/мкл хронизация процесса наблюдается у 25-30% больных, а при высоком Уровне виремии у пациента (более 2000 фг/мкл) острый гепатит В чаще всего переходит в хронический.

Выявление всей совокупности генетических изменений, характерных для HBeAg-отрицательных и других мутантных вариантов возможно пока только при непосредственном определении последовательности фрагментов вирусного генома после проведения ^ЦР. Развитие методов лабораторной диагностики гепатита В идет в направлении создания коммерческих тест-систем для определения Цинически значимых мутантных штаммов HBV, а также использования Новых оптических приборов (биосенсоров) для комплексной диагностики инфекции HBV (вирусных белков, антител к ним и ДНК HBV).

Обнаружено несколько генотипов HDV, с одним из которых (Щ) связывают наиболее тяжелые проявления эпидемического гепатита дельта в странах Латинской Америки с формированием «клеток-морул». Вспышки тяжелого острого гепатита D в Африке связывают с мутантным штаммом в позиции 1013, а хронизацию инфекции HDV - с заменой нуклеотида в позиции 170.

Вернуться на главую

См также в разделе ОБСЛЕДОВАНИЕ БОЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ ПЕЧЕНИ